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作者:[195p4r] 发布时间:[2024-06-07 23:52:43]

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表达载体典型地包括正确转录核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码目的蛋白,但是也可以编码rna,例如反义rna、sirna等。如本文所用,“表达载体”包括任何线性的或环状的重组载体,包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员根据表达系统能够选择适合的载体。在一个实施方案中,表达载体包括本文实施方案的,其可操作地连接到至少一个“调控序列”,其控制转录、翻译、起始和终止,例如转录启动子、操纵子或增强子,或mrna核糖体结合位点,并且可选地包括至少一个选择标记。

为了在合适的宿主生物体中表达,将重组构建体或构建体有利地插入到宿主特异性载体中,这使得在宿主中的佳表达成为可能。本文实施方案的替代实施方案提供了一种“改变宿主细胞中的表达”的方法。在宿主细胞或宿主生物体中可以增强或过表达或诱导本文实施方案的多核苷酸。本文提供的多核苷酸的表达的改变还会产生异位表达,其是在改变的以及在对照或野生型生物体中的一种不同的表达模式。

表达的改变是由本文一个实施方案的多肽与外源性或内源性调节剂的相互作用而发生的或者是由于多肽的化学修饰导致的。该术语还指本文实施方案的多核苷酸的改变的表达模式,其被改变至低于检测水平或者被抑制活性。在一个实施方案中,本文还提供了编码本文提供的多肽或变体多肽的分离的、重组的或合成的多核苷酸。在一个实施方案中,多种编码多肽的序列在单一宿主表达,特别是在不同启动子的控制下。在另一个实施方案中,多种编码多肽的序列可以存在于单个转化载体上,或者可以使用分离的载体并选择包含两个嵌合的转化体同时进行共转化。

类似地,一种或多种多肽编码可以与其他嵌合一起在单一植物、细胞、微生物或生物体中表达。取决于语境,术语“宿主”可以指野生型宿主或经遗传改变的重组宿主或两者。原则上,所有的原核或真核生物都可以被认为是根据本发明的或构建体的宿主或重组宿主生物。使用根据本发明的载体,可以生产重组宿主,其例如可以用至少一种根据本发明的载体转化,并可以用于生产根据本发明的多肽。有利地,将如上所述的根据本发明的重组构建体引入到合适的宿主系统中并表达。优选地,使用本领域技术人员已知的普通克隆和转染方法,例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,以在各自的表达系统中表达所述。

例如q-琼脂糖色谱,离子交换色谱和疏水色谱,以及其他常规技术,例如超滤、结晶、盐析、渗析和天然凝胶电泳来纯化多肽。为了分离重组蛋白,使用载体系统或寡核苷酸可能是有利的,所述载体系统或寡核苷酸通过限定的核苷酸序列延长cdna,并因此编码改变的多肽或融合蛋白,其例如用于更容易的纯化。

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