վ-常见的SCPCL-5妥尔油脂肪酸,粗妥尔油(CTO)是硫酸盐制法制浆厂的副产品。
编码感兴趣的特定分离的多肽的多核苷酸序列将被插入表达载体中并且任选地被可操作地连接至表达控制序列上,该表达控制序列适于在希望的宿主中表达该蛋白质。可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图和生物活性多肽在适合的宿主内的表达来确认适当的组装。如本领域所熟知的,为了在宿主中获得转染的高表达水平,可以将该可操作地连接至转录和翻译表达控制序列上,这些序列在所选的表达宿主中具有功能性。重组表达载体可以用于扩增和表达编码特异性新生抗原肽的dna。重组表达载体是可复制的dna构建体,它们具有编码特异性新生抗原肽或生物等价类似物的合成或cdna衍生的dna片段,这些dna片段被可操作地连接至适合的转录或翻译调节元件上,这些调节元件来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫。
在表达中具有调节作用的一种或多种遗传元件,例如,转录启动子或增强子;被转录成mrna并被翻译成蛋白质的结构或编码序列;适当的转录和翻译起始和终止序列,如下文所详述的。这样的调节元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。可以另外掺入通常赋予在宿主中进行复制的能力的复制起点以及有助于识别转化体的选择。当dna区域在功能上彼此相关时,将它们可操作地连接。的dna可操作地连接至多肽的dna,如果它被表达为参与多肽的分泌的前体的话;
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以使用多种多样的表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如包括来自sv牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒,诸如来自大肠杆菌的质粒包括pcr pbrpmb9及其衍生物,更宽的宿主范围质粒诸如m13和丝状单链dna噬菌体。用于表达多肽的合适的宿主细胞包括处于适当的启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。
高等真核细胞包括建立的哺乳动物来源的细胞系。还可以利用无细胞翻译系统。还有利地利用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。
可以进行哺乳动物细胞中的重组蛋白的表达,因为这样的蛋白质通常被正确折叠,适当修饰并且具有功能性。hela以及bhk细胞系。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件诸如复制起点、连接至待表达的上的合适的启动子和增强子以及其他5’或3’侧翼非转录序列和5’或3’非翻译序列,诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。可以根据任何合适的方法纯化由转化宿主产生的蛋白质。离心、差别溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。转移酶等可以附接至蛋白质上,以允许通过穿过适当的亲和柱而容易地纯化。还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和x射线晶体学的技术用物理方法表征分离的蛋白质。